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本帖最后由 煙花雨 于 2014-1-11 14:39 編輯
對蝦種苗企業(yè)的生存主要是依靠蝦苗養(yǎng)殖效果來決定的，蝦苗成活率的高低直接影響著產(chǎn)業(yè)鏈的上上下下。單胞藻對于蝦苗早期是最適合的餌料，如果培育得當，不僅可以節(jié)約成本，減少育苗水體環(huán)境負荷，尤其是對于蝦苗的發(fā)育打下堅實的基礎(chǔ)，提高成活率。結(jié)合個人的育苗感受，投喂單胞藻與不投喂的區(qū)別還是有的，比如苗的變態(tài)時間縮短，活力個頭大小，水質(zhì)均優(yōu)于未投喂單胞藻的苗，當然如果培育不得當，反作用也有，比如投喂有害菌超標的藻液，藻類老化，投喂過量等。所以合理運用，方可收到理想效果。限于個人水平，描述方法的錯誤不足之處，懇請大家指正。
一 單胞藻純培養(yǎng)室操作描述
儀器使用
(1) 超凈工作臺
使用前提前開機，打開紫外線燈和風(fēng)機開關(guān)20分鐘；超凈臺面上不存放不必要的物品，保持工作區(qū)內(nèi)的凈化氣流不受干擾，工作時盡量避免作明顯干擾氣流的動作；超凈臺保持光滑水平，光滑便于用酒精消毒布擦，水平是倒培養(yǎng)基時使培養(yǎng)皿內(nèi)平板厚度一致；工作時超凈臺周圍空氣流動要緩慢，雜菌盡量減少，所以要定期清潔消毒保種室內(nèi)，關(guān)閉門窗，盡可能減少雜菌數(shù)量；空氣過濾網(wǎng)定期清潔。
（2）真空泵和溶劑過濾器及過濾膜
此環(huán)節(jié)過濾只是為單胞藻純培養(yǎng)室（保種，提純，擴培試管級）準備清潔無菌海水。其他級別的培養(yǎng)無需此環(huán)節(jié)。
過濾膜使用0.2微米孔徑，不可用手拿，用鑷子選取；真空泵與溶劑過濾器之間通過合適口徑的橡膠管連接緊密，每次過濾要注意濾膜的過濾效果，防止濾孔阻塞影響過濾效果；濾瓶內(nèi)的濾液不能沒過濾板出水口，否則濾液將被抽吸入真空泵，導(dǎo)致真空泵損壞；
應(yīng)該使濾板內(nèi)的營養(yǎng)液過濾盡后（無水滴）才能停泵。要定期注意真空泵內(nèi)油量，注意加油。
(3) 恒溫鼓風(fēng)干燥箱
設(shè)定溫度時。先按控溫儀功能鍵SET進入溫度設(shè)定狀態(tài)，此時SP設(shè)定顯示一閃一閃，要按移動位鍵配合加鍵或減鍵，設(shè)定時先從分位數(shù)字設(shè)定，一直到百位數(shù)，設(shè)定結(jié)束需按一下功能鍵SET,此時干燥箱進入升溫狀態(tài)，加熱指示燈亮，當箱內(nèi)溫度接近設(shè)定溫度時，加熱指示燈閃動多次，控制進入恒溫狀態(tài)。使用注意事項：物品不能堆得太滿，更不能堵住出風(fēng)口，以免影響溫度均勻上升；若是有牛皮紙和保鮮膜時，溫度不能超過180度；取出物品時，箱內(nèi)外溫差不宜過高，防止玻璃器皿炸裂；橡膠制品不能放入。
（4）加濕器
配合生化培養(yǎng)箱使用。
水源是蒸餾水；不應(yīng)容器內(nèi)帶水移動加濕器；加水時應(yīng)在容器上表示的滿水線為止
應(yīng)注意的事項：平時留意觀察水箱的存水量，及時予以補充，遠離熱源，腐蝕物。
(5) 蒸汽消毒器
容器加水時，水位一定要超過電熱管，最好是到3個支撐點的下緣，如果連續(xù)使用，應(yīng)在每次消毒前補足蒸發(fā)水量，不然少水會燒壞電熱管；蓋上的放氣軟管插入消毒桶圓槽內(nèi)，對正蓋和主體的螺栓槽，依次將相對方的翼型螺母予以旋緊，使蓋與主體密合，加熱開始時，應(yīng)將放氣閥與安全閥的小手柄扳至垂直放氣方位，必須待有較急蒸汽噴出，即將小手柄扳回水平“關(guān)閉”方位。當?shù)竭_所需壓力和溫度，計算消毒時間，消毒畢后，關(guān)閉電源，待壓力指針指向0時，將放氣閥的小手柄扳至垂直放氣方位，氣放完后，打開容器蓋。物品消毒后要迅速干燥。應(yīng)注意滅菌液體時，不超過盛液體容器體積的3/4，瓶塞不可用軟木塞或未打孔的橡膠塞。滅菌器內(nèi)冷空氣必須完全排除。因為空氣的膨脹壓大于水蒸氣的膨脹壓，當水蒸氣含冷空氣時，壓力表所表示的壓力是水蒸氣壓力和部分冷空氣壓力之和，不是水蒸氣的實際壓力，而同一壓力下的實際溫度，含空氣的蒸汽低于飽和蒸汽，這樣導(dǎo)致達不了消毒效果。絕不可堵塞安全閥出氣孔，必須留空位保證其暢通放氣，發(fā)現(xiàn)超溫超壓，立即斷電。
蒸餾器
先關(guān)閉放水閥，打開進水閥，待溢水皮管有水流出，方可接通電源，此時可暫時關(guān)閉進水閥，待出水皮管有蒸餾水流出，打開進水閥，制備蒸餾水。定期清洗蒸餾器內(nèi)壁，除去水垢，不然影響蒸餾水質(zhì)量和使用效果。切不可關(guān)閉水閥制備蒸餾水，否則燒壞電熱管。
（6）鼓風(fēng)機
定期更換吸氣口的過濾棉，異常情況，請電工檢查
（7）空調(diào)
保種室若有生長藻種，需維持恒定溫度，反之關(guān)閉。一級，二級空調(diào)視外界氣溫調(diào)整開關(guān)。
二 衛(wèi)生消毒
工具衛(wèi)生消毒
1 濾水筒式過濾器。筒式過濾器的濾芯應(yīng)用一次更換一次，用過的濾芯浸泡在1%鹽酸溶液中消毒12h以上。然后用洗潔精清洗，再用足量清水沖洗干凈，晾干備用。（濾芯規(guī)格應(yīng)小于等于0.5微米）。
2 試管（規(guī)格10毫升到20毫升），錐形瓶（50毫升到200毫升），500ml錐形瓶，2.5L瓶廣口瓶，移液管，移液槍管/盒，玻璃氣管，膠氣管，氣石，溶劑過濾器，培養(yǎng)皿。用過后應(yīng)當用清水清洗后浸泡于1% 鹽酸12h以上（溶劑過濾器除外，浸泡時相近大小器皿分類放不同的消毒桶，規(guī)格相差大，易導(dǎo)致相互碰撞碎爛）然后用洗潔精清洗(用毛刷清洗試管底部時，不可太用力，否則底部易破裂)，再用大量清水沖洗干凈，風(fēng)干或曬干，高壓滅菌后，放入恒溫干燥箱（膠氣管，氣石除外）干燥備用。
3聚乙烯藻袋 用于二級藻類藻種掛袋培養(yǎng)或3級擴培（一般使用盛裝藻液12升左右）。先用清水沖洗干凈內(nèi)外，浸泡于1% 鹽酸12h以上，再用大量清水沖洗干凈，風(fēng)干或曬干，備用。由于藻袋近似密封性，對于防止微生物污染有很好的效果。
4毛巾 保種室 ，一級和二級毛巾不可混用，所用毛巾后都應(yīng)消毒清洗晾干后備用。
5錫箔紙 除非粘上油污或污物以及破損，都應(yīng)重復(fù)使用
6牛皮紙 定期拿到烘箱烘干
7定期更換空氣過濾器（用于1，2級培養(yǎng)的進氣過濾）的濾芯，濾芯已油化或沖散的棄去。
8定期更換鼓風(fēng)機進風(fēng)口的過濾棉
9對新購入的器皿應(yīng)先除去包裝沾染的污垢后，用洗潔精刷洗，流水沖凈，再浸泡于1%的鹽酸12h，使游離的堿性物質(zhì)除去，再用清水沖洗干凈，風(fēng)干或曬干備用。
室內(nèi)衛(wèi)生消毒
1保種室每天早上用清水擦洗實驗臺面，地板，墻壁，木架后，開紫外燈消毒20分鐘，此時關(guān)掉空調(diào)，關(guān)掉日光燈，由于紫外燈照射會產(chǎn)生一定量的臭氧，對人體有害，所以消毒關(guān)閉紫外燈后人應(yīng)隔一段時間再進去。進保種室換鞋。
2一級和二級室每天清潔，接種前接種后承載物框架都應(yīng)用消毒液消毒。
3門口消毒池定期更換消毒藥水（高錳酸鉀）
4常用消毒劑濃度 1%鹽酸，次氯酸鈉20ppm（有效氯），碘液（1000ppm）,酒精70-75%,高錳酸鉀1mg/L.
三 接種
藻種固體培養(yǎng)基制備
所需燒杯，玻棒須清洗干凈，錐形瓶和培養(yǎng)皿須消毒清洗滅菌烘干。將稱好的純化瓊脂粉加入燒杯再加入一定量的海水，加熱（必須不停攪拌，以免瓊脂糊底燒焦）至完全融化，加熱后的瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)當透明無顯著沉淀，若明顯，可采用清潔的白色薄絨布或中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布鋪在漏斗上趁熱過濾，融化畢后精確加入營養(yǎng)鹽（維生素B溶液須等培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至50攝氏度以下再加）。培養(yǎng)基采用121攝氏度高壓蒸汽滅菌20至30分鐘即可，培養(yǎng)基滅菌后應(yīng)立即取出，冷卻至50攝氏度以下，即加維生素B溶液。將盛裝培養(yǎng)基的錐形瓶和培養(yǎng)皿放在超凈工作臺上，點燃酒精燈，右手托起錐形瓶底，將瓶口在酒精燈稍加燒，然后迅速將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，以鋪滿皿底為止（厚薄適中）。鋪放好后，放置20-30分鐘，待培養(yǎng)基凝固后，即開始操作。若是做斜面培養(yǎng)基，則加入維生素B溶液后，將盛裝培養(yǎng)基的錐形瓶和試管以及一根厚約1厘米的小木板放在超凈工作臺上。分裝約為試管高度的1/3-2/3（視情況操作），分裝量應(yīng)以能形成2/3底層和1/3斜面量為好，擺置成適當斜面，待其自然凝固。培養(yǎng)基制備好后，如發(fā)現(xiàn)破裂，水分浸入，色澤異常等均應(yīng)棄去.
待凝固后即進行操作，現(xiàn)一般采用平板劃線接種和涂布接種。
平板劃線接種
接種環(huán)在酒精燈火焰上充分燒紅后，接種柄一邊轉(zhuǎn)動一邊慢慢來回通過火焰3次，待冷卻至室溫方可挑取藻種（為保證藻種不被燙死，挑種前可將接種環(huán)接觸培養(yǎng)皿內(nèi)壁或培養(yǎng)基），迅速接種至新培養(yǎng)基（劃線可采用斜線法，方格法，曲線法，放射法等）。左手握住平板，用大拇指和食指稍稍抬起皿蓋，同時靠近火焰周圍，右手持接種環(huán)伸入皿內(nèi)，在平板上一個區(qū)域作劃線（依方法不同，動作不同）。劃線時使接種環(huán)與平板表面成30-40度角輕輕接觸，以腕力在表面作較快的滑動（注意不要劃破平板表面或伸進培養(yǎng)基內(nèi)）。接種環(huán)挑種后和劃線完抽出時均不可碰及皿壁/口，更不能碰其它物體和臺面。接種完后，將接種環(huán)從柄部至環(huán)端逐漸通過酒精燈火焰滅菌，不能直接燒環(huán)，以免殘留在接種環(huán)上的藻體或菌體爆濺污染空間。上述操作完成后，即用無菌封口膜封培養(yǎng)皿口（膜使用前須用酒精消毒，紫外燈消毒，風(fēng)干），封口時，用左手大拇指摁住膜一邊末端，右手大拇指和食指捏住另一邊末端，迅速繞培養(yǎng)皿口繞一圈，封口。
涂布接種
所用種液必須經(jīng)過弧菌檢測合格后方可使用。涂布棒在火焰上慢慢來回過火焰3次，冷卻（不可驟冷），將種液用移液槍從試管吸出注入平板上面（槍管不可碰及試管外壁，更不能碰及其它物品或臺面），迅速用涂布棒在表面作來回左右的涂布，讓藻液分布均勻，畢后，封口同平板劃線。
補充：試管液體培養(yǎng)基接種
所用種液必須經(jīng)過弧菌檢測合格后方可使用。火焰滅菌前試管口外壁不能有水滴（易導(dǎo)致受熱不均而破裂）,燒試管口時，試管傾斜45度角，不斷移動試管，使試管口受熱均勻，滅菌時間3秒左右。滅菌后不能驟冷，防止試管破裂。畢后，用盛裝營養(yǎng)液150或200ml的錐形瓶（也要滅菌瓶口）向試管中傾倒營養(yǎng)液，每次只能拿一個試管（注：若幾個試管對比時，可以同時拿在手里，用大拇指和手掌），倒好后，同樣試管和錐形瓶口滅菌，試管塞也要滅菌，塞試管塞時不要移動試管迎接塞，以免試管在移動中納入可能含菌空氣，火焰旁為無菌。
所有試管分裝好后，即接種。用移液槍選取移液量（試管口滅菌），注入新培養(yǎng)基，槍管不可碰及管外壁，更不能碰及其它物品或臺面，一支槍管只能和同一種液使用，選取另一試管種液時必須更換槍頭。接種畢后，選取合適光照溫度培養(yǎng)。由于試管培養(yǎng)是靜置培養(yǎng)，而在靜置條件下，藻細胞會聚集在試管底部，且藻細胞周圍會形成透過養(yǎng)分的屏障，營養(yǎng)鹽的攝入受阻，光照吸收不均，為使營養(yǎng)鹽攝入正常，藻細胞受光均勻，需要定時搖置試管（手先噴消毒酒精，手腕使勁搖，不要擺臂，不能倒置搖）
三角瓶，500ml瓶，2.5L瓶液體培養(yǎng)基接種
三角瓶接種需無菌操作。500ml瓶，2.5L瓶液體培養(yǎng)基接種均在室內(nèi)衛(wèi)生條件下操作。3種瓶和所需營養(yǎng)液及錫紙，移液管，洗耳球，氣管，氣石均需經(jīng)消毒清洗，滅菌后使用。三角瓶需定時搖置，500ml，2.5L瓶培養(yǎng)在通氣條件下培養(yǎng)。
二級聚乙烯藻袋液體培養(yǎng)基接種
氣管，氣石均需經(jīng)消毒清洗，滅菌后使用，抽藻管前次用畢后應(yīng)當用水泵將管內(nèi)灌滿消毒鹽酸溶液，今次用前需用海水或淡水沖洗干凈后使用。選取的種液應(yīng)當是無明顯沉淀，泡沫，原生動物，附著物，色澤正常，藻細胞密度大，形態(tài)正常，弧菌檢測合格后選用。所用海水漂白水消毒有效氯應(yīng)足10ppm，曝氣12小時，檢測余氯，加硫代硫酸鈉中和，方可使用。若使用稀釋的漂白水，應(yīng)當天配制當天使用，而未使用的要在24小時后棄去。且稀釋的漂白水必須加蓋放在避光的容器內(nèi)保存。由于漂白水會隨時間漸漸分解，一次性購入的漂白水不應(yīng)太多，不要過量儲存，以免影響滅菌功效。
1,2，3級接藻示意：
試管 → 三角瓶 → 500ml瓶子 → 2500ml瓶子→ 20升的藻種聚乙烯袋 → 18升的擴培藻聚乙烯袋或者培藻池
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狗仔卡
發(fā)表于 2014-1-10 10:15:03
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發(fā)表于 2015-6-27 21:16:46
