對(duì)蝦腸胞蟲(chóng)病 (EHP) 的新管理方法

一片云

　　針對(duì)對(duì)蝦腸胞蟲(chóng)病的新管理方法


　　隨著微孢子寄生蟲(chóng)的出現(xiàn)，對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病（EHP）使得世界各地蝦農(nóng)產(chǎn)量損失嚴(yán)重。本文描述的最新的檢測(cè)方法和管理方法對(duì)應(yīng)對(duì)該疾病將起到關(guān)鍵作用。

　　不同種類(lèi)的微孢子蟲(chóng)會(huì)對(duì)對(duì)蝦的肌肉組織，心臟，性腺，鰓，肝胰臟，和神經(jīng)節(jié)產(chǎn)生感染。對(duì)蝦微孢子蟲(chóng)被視為對(duì)蝦群體一個(gè)潛在威脅，并且會(huì)對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益造成影響。近期，一種叫對(duì)蝦腸胞蟲(chóng)病(EHP)的微孢子被發(fā)現(xiàn)存在于對(duì)蝦的肝胰腺中的小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。在一些東南亞國(guó)家，例如越南，泰國(guó)，馬來(lái)西亞，印度尼西亞，中國(guó)和印度的對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)已經(jīng)相繼發(fā)現(xiàn)此類(lèi)微孢子的存在。對(duì)蝦腸胞蟲(chóng)病(EHP)的臨床癥狀還未具體化，但已發(fā)現(xiàn)與對(duì)蝦發(fā)育遲緩有關(guān)聯(lián)。

　　對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病(EHP)的組織病理學(xué)

　　在檢查被對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病（EHP）感染的來(lái)自越南的南美白對(duì)蝦（2014）樣本中發(fā)現(xiàn)肝胰腺小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中存在嗜堿細(xì)胞內(nèi)含物（圖1A&1B）。 在這實(shí)驗(yàn)中，孢蟲(chóng)呈現(xiàn)出原形體階段,成熟嗜堿性的孢子也被檢測(cè)到。被對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病（EHP）感染的來(lái)自文萊的藍(lán)對(duì)蝦（2006）也發(fā)現(xiàn)微孢子蟲(chóng)存在于肝胰腺（圖1C）。這些結(jié)果顯示對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病（EHP）早在2006年就存在在亞洲。

　　對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病的聚合酶鏈反應(yīng)

　　

　　圖1：對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病(EHP)組織病理學(xué)顯現(xiàn)在感染的對(duì)蝦上。（A&B）南美白對(duì)蝦的肝臟胰組織，（C）藍(lán)對(duì)蝦。箭頭代表成熟的孢子；星星代表原形體階段。（比例=25μm.）

　　我們選擇用來(lái)檢測(cè)對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病（EHP）的染色體底物包括EHP-510F (5’-GCCTGAGAGATGGCTCCCACG) 和 EHP-510R (5’-GCGTACTATCCCCAGAGCCCG)。用已經(jīng)受感染的對(duì)蝦DNA提取物實(shí)施聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。結(jié)果顯示這個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)能夠檢測(cè)出已受感染的對(duì)蝦（圖2，1-3行）；染病對(duì)蝦的排泄物以及水質(zhì)樣本均被檢測(cè)出感染對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)（EHP）（圖2，4-5行）。同時(shí)我們也檢測(cè)了另外兩種寄生蟲(chóng)病原體：阿米巴蟲(chóng)和蝦白肉病微孢子蟲(chóng)，然而這些對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病（EHP）底物并沒(méi)有與該兩種病蟲(chóng)發(fā)生交叉反應(yīng)（圖2，6-7行）。

　　
　　圖 2. 對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病毒聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病毒（EHP）。M: 1 kb以上的階梯型分子量標(biāo)準(zhǔn)。 從越南收集來(lái)的南美白對(duì)蝦樣本（第一行，2014年樣本；第二行，2015年樣本）和來(lái)自泰國(guó)（3-5行，無(wú)特定病原體對(duì)蝦，排泄物和水），感染白肉病的斑節(jié)對(duì)蝦（第六行），感染阿米巴蟲(chóng)的南美白對(duì)蝦（第七行），無(wú)特定病原體的南美白對(duì)蝦（第八行），鹵蟲(chóng)生物樣本（第九行），無(wú)操作對(duì)照組（第十行）。

　　令人意外的是，我們從4/9的冷凍鹵蟲(chóng)生物樣本中檢測(cè)出對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病(EHP)（圖2，9行，一個(gè)非常具有代表性的樣本）。在這些對(duì)對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病(EHP)呈陽(yáng)性的樣本中，18S rRNA基因被擴(kuò)充和重新排列。這個(gè)被修改的序列與來(lái)自越南的對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病樣本有99.9%的相似，也就是說(shuō)鹵蟲(chóng)中所帶有的對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病毒(EHP)很可能源自東南亞。

　　對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病傳播的研究

　　以上三個(gè)生物測(cè)定均使用來(lái)自泰國(guó)的已感染對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病的對(duì)蝦樣本。在第一個(gè)生物測(cè)定（共棲組）中，染病對(duì)蝦被轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)缸中與用高彈體標(biāo)記的無(wú)特定病原體的對(duì)蝦一起生活。35天后，無(wú)特定病原體的對(duì)蝦感染對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病毒（圖3A）。在第二個(gè)生物測(cè)定（水生感染組）中，用曾飼養(yǎng)過(guò)染病對(duì)蝦的水體轉(zhuǎn)移到無(wú)特定病原體的對(duì)蝦實(shí)驗(yàn)缸中。42天以后，無(wú)特定病原體的對(duì)蝦依舊沒(méi)有感染病毒（圖3A）。在第三個(gè)生物測(cè)定中，用染病對(duì)蝦的肝胰腺喂養(yǎng)無(wú)特定病原體的對(duì)蝦，每隔五天用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）分析樣本；15天后，無(wú)特定病原體的對(duì)蝦感染病毒（圖3B）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病毒（EHP）可以通過(guò)嗜食同類(lèi)傳播。
　　
　　圖3：聚合酶鏈反應(yīng)生物檢測(cè)1，生物檢測(cè)2，以及生物檢測(cè)3的肝胰腺樣本。（A）35天后檢測(cè)出共棲組存在EHP，但是不能檢測(cè)到水生感染組。（B）15天后，EHP在（嗜食同類(lèi)）被檢測(cè)到。

　　原位雜交（ISH）

　　通過(guò)用地高辛標(biāo)記法標(biāo)記的對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病進(jìn)行原位雜交，染病的南美白對(duì)蝦（圖4A）和藍(lán)對(duì)蝦（圖4B）顯示微孢子（嗜堿性的內(nèi)含物）存在于肝胰腺小管的上皮細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)中的探針具有非常高的識(shí)別敏銳性，在已感染蝦白肉病的斑節(jié)對(duì)蝦中，該探針無(wú)任何反應(yīng)顯示（圖4C）。
　　
　　圖4. 用地高辛標(biāo)記法標(biāo)記的對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病(EHP)探針在對(duì)連續(xù)部位進(jìn)行原位雜交。深藍(lán)色沉淀物表示對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病(EHP)的出現(xiàn)（A）用對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病(EHP)探針對(duì)南美白對(duì)蝦（越南）進(jìn)行原位雜交；（B）藍(lán)對(duì)蝦（文萊）；（C）斑節(jié)對(duì)蝦表現(xiàn)出了白肉病癥狀（馬達(dá)加斯加），插入圖片（D）：使用Perezia penaei探針的原位雜交。比例條＝25 μm。

　　結(jié)語(yǔ)

　　對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病(EHP)在養(yǎng)殖對(duì)蝦中的傳播可能還會(huì)繼續(xù)，需要通過(guò)建立有效的方法來(lái)監(jiān)控這種寄生蟲(chóng)的發(fā)病和傳播。所以通過(guò)用敏銳的分子生物學(xué)方法去檢測(cè)對(duì)蝦，活餌料和蝦塘環(huán)境的對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病(EHP)會(huì)非常有效。感染對(duì)蝦腸孢蟲(chóng)病(EHP）的對(duì)蝦通常不能被肉眼識(shí)別，因?yàn)镋HP不會(huì)呈現(xiàn)臨床癥狀。本研究表明基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和原位雜交（ISH）的檢測(cè)方法和診斷步驟具有具體性和靈敏性，可作為有效的常規(guī)診斷方法去檢測(cè)對(duì)蝦養(yǎng)殖群體，池塘環(huán)境和對(duì)蝦產(chǎn)品。

文章來(lái)源于This article was originally published on the Advocate in English on April 15, 2016.

0928

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一片云

0928 發(fā)表于 2016-7-24 00:11
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